Thực hiện chẩn đoán bệnh còi ở tôm giống bằng phương pháp RT PCR dựa trên nguyên tắc nào?
Theo tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 1: bệnh còi do vi rút ở tôm quy định về phương pháp chẩn đoán bệnh ở tôm như sau:
"3. Phương pháp chẩn đoán
...
3.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm
3.2.1 Phương pháp PCR
tích) và etanol tuyệt đối.
3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp nhuộm Giemsa
3.2.1 Dung dịch Giemsa đậm đặc (xem A.1).
3.2.2 Dung dịch đệm phosphat (xem A.2).
CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thuốc nhuộm Giemsa thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất
3.3 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR
– Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm quy định về nguyên tắc phương pháp PCR như sau:
"3. Phương pháp chẩn đoán
...
3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
3.2.1. Phương pháp PCR
3.2.1.1. Nguyên tắc
Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham gia của mồi, bốn loại
dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có nuclease, trừ khi có quy định khác.
3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung
3.1.1 Etanol, 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối.
3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp nhuộm Giemsa
3.2.1 Dung dịch
% đến 100 % (C2H6O)
3.1.2 Dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS) (xem A.2)
3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT- nested PCR (Reverse Transcription nested Polymerase Chain Reaction) và realtime RT-PCR (realtime Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)
3.2.1 Mồi (primers) RT - nested PCR, gồm mồi xuôi và mồi
(Ethanol), từ 70% đến 100%;
3.1.2 Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), pH 7,2 ± 0,2 (xem Phụ lục A);
3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho PCR, realtime PCR;
3.2.1 Kít chiết tách ADN/ARN vi rút;
3.2.2 Kít nhân gen PCR, realtime PCR;
3.2.3 Nước tinh khiết, không có DNAse và RNAse.
3.2.4 Bột agarose, dung dịch TBE 10X;
3.2.5 Chất nhuộm gel (ví dụ
lục A);
3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho PCR, realtime PCR;
3.2.1 Kít chiết tách ADN/ARN vi rút;
3.2.2 Kít nhân gen PCR, realtime PCR;
3.2.3 Nước tinh khiết, không có DNAse và RNAse.
3.2.4 Bột agarose, dung dịch TBE 10X;
3.2.5 Chất nhuộm gel (ví dụ: GelRed hoặc chất nhuộm gel tương đương);
3.2.6 Dung dịch nạp mẫu (Loading dye);
3
mẫu
3.1.1 Cồn (Ethanol), từ 70% đến 100%;
3.1.2 Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), pH 7,2 ± 0,2 (xem Phụ lục A);
3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho PCR, realtime PCR;
3.2.1 Kít chiết tách ADN/ARN vi rút;
3.2.2 Kít nhân gen PCR, realtime PCR;
3.2.3 Nước tinh khiết, không có DNAse và RNAse.
3.2.4 Bột agarose, dung dịch TBE 10X;
3.2.5 Chất
Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết để phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước tinh khiết, trừ các trường hợp có quy định khác.
3.1. Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung.
3.1.1. Etanol, 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối.
3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR.
3.2.1. Cặp mồi
trường hợp có quy định khác.
3.1. Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung.
3.1.1. Etanol, 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối.
3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR.
3.2.1. Cặp mồi (primers), gồm mồi xuôi và mồi ngược.
3.2.2. Agarose.
3.2.3. Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris
mồi.
Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.1.1) theo phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của A. invadans sử dụng cặp mồi ITS1-2F/ITSR1 (3.2.1). Trình tự cặp mồi được nêu trong bảng 1.
Cặp mồi ITS1-2F/ITSR1 dùng để khuếch đại đoạn gen của nấm A invadans có kích thước 234 bộ
Mồi được chuẩn bị như sau:
Chuẩn bị mồi gốc
liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR và Realtime PCR
3.2.1 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược.
3.2.2 Cặp mồi, Dò (Probe)
3.2.3 Kít tách chiết ADN (Xem B1 và B2).
3.2.4 Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit, Cat. No K0171).
3.2.5 Kít nhân gen realtime PCR (Ví dụ: Kit Platinum® Quantitative PCR SuperMix-UDG, Cat.No: 11730-017).
3.2.6 Dung
tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.
3.1. Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung.
3.1.1. Etanol, từ 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối.
3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp giám định sinh hóa.
3.2.1. Thạch dinh dưỡng (NA
định sinh hóa.
3.2.1. Thạch dinh dưỡng (NA).
3.2.2. Thạch chọn lọc Aeromonas spp. (Rimler-Shotts - R-S).
3.2.3. Thuốc thử cho phương pháp nhuộm Gram (xem A.1).
3.3. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp PCR.
3.3.1. Cặp mồi (primes), gồm mồi xuôi và mồi ngược.
3.3.2. Agarose.
3.3.3. Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris
vật liệu thử dùng chung
3.1.1 Etanol, từ 96 % đến 100 % (thể tích).
3.1.2 Dung dịch muối đệm phosphate (PBS)
3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) và Realtime RT PCR.
3.2.1 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược RT PCR.
3.2.2 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược, Dò
dịch muối đệm phosphate (PBS)
3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) và Realtime RT PCR.
3.2.1 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược RT PCR.
3.2.2 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược, Dò (Probe) Realtime RT PCR.
3.2.3 Kít tách chiết ARN (acid deoxyribo nucleic).
3
dạng tròn, lồi, nhẵn có màu vàng nhạt.
- Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào môi trường NA (3.2.1). Ủ trong tủ ấm (4.1.4) để kiểm tra hình thái và xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn. Trên môi trường NA, khuẩn lạc của Aeromonas hydrophila có dạng hình tròn, hơi lồi, nhẵn và có màu trắng đục
6.1.4.2. Xác định vi khuẩn.
6.1.4.2.1. Quan sát hình
, trừ các trường hợp có quy định khác.
3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung
3.1.1 Etanol, từ 96 % đến 100 % (thể tích).
3.1.2 Dung dịch muối đệm phosphate (PBS)
3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) và Realtime RT PCR.
3.2.1 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược
(028) 3930 3279
Hỗ trợ trực tuyến
0906 22 99 66
Quá trình chạy điện di khi thực hiện phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh còi ở tôm gồm mấy bước thực hiện?
01:08 | 13/07/2022
