Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9515:2017 hướng dẫn nguyên tắc xác định các nucleotid bằng sắc ký lỏng ra sao?

Nội dung chính

• Nguyên tắc xác định các nucleotid bằng sắc ký lỏng ra sao?
• Thuốc thử và vật liệu thử khi xác định các nucleotid bằng sắc ký lỏng là gì?
• Thiết bị, dụng cụ theo quy định Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9515:2017 ra sao?

Thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh (infant formula) là sản phẩm thay thế sữa mẹ được chế biến đặc biệt đáp ứng được các nhu cầu về dinh dưỡng của trẻ trong những tháng đầu đời đến giai đoạn ăn thức ăn bổ sung thích hợp.

Nguyên tắc xác định các nucleotid bằng sắc ký lỏng ra sao?

Căn cứ Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9515:2017, nguyên tắc xác định các nucleotid bằng sắc ký lỏng như sau:

Mẫu thử được hòa tan trong dung dịch có nồng độ muối cao để ức chế sự tương tác giữa protein và chất béo.

Các hợp chất 5'-mononucleotid gồm uridin 5-monophosphat (UMP), inosin 5'-monophosphat (IMP), adenosin 5'-monophosphat (AMP), guanosin 5'-monophosphat (GMP) và cytidin 5'-phosphat (CMP) được tách khỏi nền mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn trao đổi anion mạnh (SPE) sau đó phân tích bằng sắc ký dùng cột pha tĩnh C18, có gradient rửa giải, detector UV và định lượng bằng kỹ thuật nội chuẩn dùng thymidin 5'-monophosphat (TMP).

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9515:2017 hướng dẫn nguyên tắc xác định các nucleotid bằng sắc ký lỏng ra sao? (Hình từ Internet)

Thuốc thử và vật liệu thử khi xác định các nucleotid bằng sắc ký lỏng là gì?

Căn cứ Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9515:2017 quy định thuốc thử và vật liệu thử khi xác định các nucleotid bằng sắc ký lỏng như sau:

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

- Chất chuẩn, có độ tinh khiết ≥ 99% (của Sigma1) hoặc tương đương). Các muối natri nucleotid hoặc muối natri hydrat có thể được sử dụng thay thế nếu không có sẵn các dạng axit tự do.

+ TMP, thymidin 5'-monophosphat, CAS số. 365-07-1.

+ AMP, adenosin 5'-monophosphat, CAS số. 61-19-8.

+ CMP, cytidin 5’-phosphat, CAS số. 63-37-6.

+ GMP, guanosin 5'-monophosphat, CAS số. 85-32-5.

+ IMP, inosin 5'-monophosphat, CAS số. 131-99-7.

+ UMP, uridin 5'-monophosphat, CAS số. 58-97-9.

- Kali bromua (KBr).

- Kali dihydro phosphat (KH2PO4).

- Axit orthophosphoric (H3PO4).

- Kali hydroxit (KOH).

- Axit etylendiamintetraaxetic (EDTA), muối dinatri dihydrat

- Natri clorua (NaCI).

- Metanol (CH3OH).

- Chuẩn bị thuốc thử

+ Dung dịch đệm chuẩn hóa [KH2PO4), c = 0,25 mol/l, pH 3,5]

Hòa tan 34,0 g kali dihydro phosphat trong 900 ml nước và chỉnh pH đến 3,5 bằng axit orthophosphoric. Pha loãng đến 1 lít.

+ Dung dịch chiết, (NaCI, c = 1 mol/l và EDTA c = 4 mmol/l)

Hòa tan 58,5 g natri clorua và 1,5 g EDTA trong nước. Pha loãng đến 1 lít.

+ Dung dịch rửa (KBr, c = 0,3 mol/l).

Hòa tan 3,6 g kali bromua (4.2) trong 100 ml nước.

+ Dung dịch rửa giải (KH2PO4, c = 0,5 mol/l, pH = 3,0)

Hòa tan 6,8 g kali dihydro phosphat (4.3) trong 90 ml nước và chỉnh pH đến 3,0 bằng axit orthophosphoric (4.4). Pha loãng đến 100 ml.

+ Pha động A (KH2PO4, c = 10 mmol/l, pH = 5,6)

Hòa tan 1,4 g kali dihydro phosphat trong 900 ml nước và chỉnh pH đến 5,6 ±0,1 bằng dung dịch kali hydroxit [10% (khối lượng/thể tích)]. Pha loãng bằng nước đến 1 lít. Chuẩn bị dung dịch trong ngày sử dụng để tránh sự phát triển của vi sinh vật trong đệm phosphat ở nhiệt độ phòng khi dung dịch đệm chứa hàm lượng dung môi vô cơ thấp hoặc không chứa dung môi vô cơ.

+ Pha động B, 100% metanol.

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn

+ Dung dịch chuẩn gốc, ρ ≈ 1 mg/ml

Cân chính xác khoảng 50 mg mỗi chất chuẩn 5’-monophosphat nucleotid cho vào các bình định mức 50 ml riêng rẽ. Thêm 40 ml nước, trộn đến khi hòa tan và thêm nước đến vạch.

+ Dung dịch chuẩn tinh khiết

Dùng pipet lấy 1,0 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc cho vào các bình định mức 50 ml riêng rẽ, thêm dung dịch đệm chuẩn hóa đến vạch và đo độ hấp thụ tại bước sóng hấp thụ cực đại λmax để xác định nồng độ của mỗi dung dịch chuẩn gốc nucleotid.

Bảng 1 - Bước sóng hấp thụ cực đại và hệ số tắt của các 5'-monophosphat nucleotid

+ Dung dịch nội chuẩn, ρ ≈ 80 μg/ml

Pha loãng 4 ml dung dịch chuẩn gốc TMP trong 50 ml nước.

+ Dung dịch chuẩn làm việc, ρ ≈ 40 μg/ml

Dùng pipet lấy 2 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc (AMP, CMP, GMP, IMP và UMP) cho vào một bình định mức 50 ml và thêm nước đến vạch.

+ Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn. Xem Bảng 2 về các nồng độ danh nghĩa nucleotid của các dung dịch chuẩn hiệu chuẩn.

Bảng 2 - Nồng độ danh nghĩa của các dung dịch chuẩn hiệu chuẩn

++ Dung dịch hiệu chuẩn 1

Dùng pipet lấy 0,25 ml dung dịch chuẩn làm việc và 1 ml dung dịch nội chuẩn cho vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

++ Dung dịch hiệu chuẩn 2

Dùng pipet lấy 0,5 ml dung dịch chuẩn làm việc và 1 ml dung dịch nội chuẩn cho vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

++ Dung dịch hiệu chuẩn 3

Dùng pipet lấy 2 ml dung dịch chuẩn làm việc và 1 ml dung dịch nội chuẩn cho vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

++ Dung dịch hiệu chuẩn 4

Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch chuẩn làm việc và 1 ml dung dịch nội chuẩn cho vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

Thiết bị, dụng cụ theo quy định Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9515:2017 ra sao?

Căn cứ Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9515:2017, sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

- Hệ thống HPLC, được trang bị bơm, bộ bơm mẫu với vòng bơm 50 μl, bộ khử khí, buồng cột và detector mảng diot quang.

- Cột C18, loại Gemini2) có cỡ hạt 5 μm, kích thước 250 mm x 4,6 mm (Phenomenex2)).

- Máy đo phổ, có thể cho số đọc đến ba chữ số sau dấu phẩy.

- Dụng cụ đo pH.

- Máy ly tâm.

- Ống ly tâm, Amicon Ultra MWCO 3k, dung tích 4 ml (Millipore)2).

- Ống ly tâm polypropylen, dung tích 50 ml.

- Xyranh sử dụng một lần, dung tích 3 ml.

- Bộ lọc xyranh, với màng lọc bằng xenlulo axetat, cỡ lỗ 0,2 μm.

- Bộ bơm chân không SPE.

- Cột SPE trao đổi anion mạnh polypropylen, 6 ml x 1 000 mg, Chromabond SB2).

- Màng lọc, bằng nylon cỡ lỗ 0,45 μm.