Dùng phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm có cho kết quả chính xác không?

Nội dung chính

• Mẫu bệnh phẩm dùng cho phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn cần được chuẩn bị như thế nào?
• Thực hiện phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn như thế nào để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm sú?
• Dùng phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm có cho kết quả chính xác không?

Mẫu bệnh phẩm dùng cho phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn cần được chuẩn bị như thế nào?

Theo tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm quy định về việc lấy mẫu và xử lý mẫu như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm

6.1.1 Lấy mẫu

- Tôm trưởng thành và tôm bố mẹ (lớn hơn 25 ngày tuổi): Thu nguyên con, hoặc thu các loại mẫu: gan, tụy và đầu. Mẫu có thể được gộp từ 1 mẫu đến 5 mẫu thành 1 mẫu xét nghiệm.

- Ấu trùng hoặc hậu ấu trùng tôm (postlarvae) (từ 1 ngày tuổi đến 25 ngày tuổi): Thu nguyên con, lượng mẫu ít nhất khoảng 1 g/mẫu.

Mẫu tôm phải còn sống hoặc vừa mới chết. Mẫu không dập nát. Mẫu phải được lấy vô trùng, các bộ phận phải để riêng biệt trong từng túi hay lọ vô trùng bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8°C (không bảo quản mẫu xét nghiệm vi trùng ở nhiệt độ âm). Bệnh phẩm từ lúc lấy cho tới khi thực hiện xét nghiệm không được quá 24 giờ.

6.1.2 Xử lý mẫu

Mẫu sau khi lấy (xem 6.1.1), tiến hành cắt nhuyễn hoặc nghiền nát ít nhất 1 g mẫu, trộn đều tạo thành hỗn hợp mẫu đồng nhất.

...

Theo đó, tùy vào mẫu bệnh phẩm mà thực hiện lấy mẫu như sau:

-Tôm trưởng thành và tôm bố mẹ (lớn hơn 25 ngày tuổi): Thu nguyên con, hoặc thu các loại mẫu: gan, tụy và đầu. Mẫu có thể được gộp từ 1 mẫu đến 5 mẫu thành 1 mẫu xét nghiệm.

- Ấu trùng hoặc hậu ấu trùng tôm (postlarvae) (từ 1 ngày tuổi đến 25 ngày tuổi): Thu nguyên con, lượng mẫu ít nhất khoảng 1 g/mẫu.

Mẫu sau khi lấy được mẫu bệnh phẩm cần tiến hành cắt nhuyễn hoặc nghiền nát ít nhất 1 g mẫu, trộn đều tạo thành hỗn hợp mẫu đồng nhất.

Dùng phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm có cho kết quả chính xác không? (Hình từ Internet)

Thực hiện phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn như thế nào để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm sú?

Theo tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm quy định về cách tiến hành phương pháp nuôi cấy phân lập định danh vi khuẩn để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm sú như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phát hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm

6.2.1 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

6.2.1.1 Phân lập vi khuẩn

Dùng que cấy vô trùng cấy ria mẫu lên môi trường thạch TCBS (xem 3.2.1), ủ các đĩa thạch trong tủ ấm ở 28 °C đến 30 °C trong vòng 18 giờ đến 24 giờ.

Trên môi trường TCBS:

+ Khuẩn lạc phẳng, màu vàng, đường kính 2 mm - 3 mm: Vibrio cholerae, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii.

+ Khuẩn lạc phẳng, màu xanh lá, đường kính 2 mm - 3 mm: Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio mimicus.

Dùng que cây vô trùng, chọn khuẩn lạc điển hình (xanh, vàng) cấy ria trên môl trường thạch TSA (xem 4.2.2) 1 % NaCl (xem 4.2.3) ủ ở 28 °C đến 30 °C trong vòng 18 giờ đến 24 giờ. Lấy khuẩn lạc thuần thu được đi nhuộm gram và kiểm tra sinh hóa.

6.2.1.2 Quan sát hình thái, sử dụng phương pháp nhuộm Gram

Nhỏ một giọt nước muối sinh lý trên phiến kính, dùng que cấy vô trùng chuyển khuẩn lạc thuần trên môi trường TSA 1 % NaCl (xem 6.2.1.1) vào giọt nước rồi trộn đều, dàn mỏng, để khô tự nhiên sau đó cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. Tiêu bản sau khi cố định được nhuộm bằng máy nhuộm gram tự động (nếu có) hoặc phương pháp gram (xem phụ lục B).

Soi trên kính hiển vi ở vật kính dầu với độ phóng đại 100 lần, vi khuẩn Vibrio bắt màu hồng (màu gram âm), hình que thẳng hoặc hơi cong, không hình thành bào tử và có tiên mao.

6.2.1.3 Đặc tính sinh hóa

Xác định các đăc tính sinh hóa của vi khuẩn dựa vào mốt số chỉ tiêu cơ bản như vi khuẩn gram âm, di động và các chỉ tiêu sinh hóa nêu trong Bảng 1.

Theo đó, cách tiến hành phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm sú được thực hiện theo tiêu chuẩn nêu trên.

Dùng phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm có cho kết quả chính xác không?

Theo Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm quy định về kết luận chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm sú bằng phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn như sau:

Kết luận

Tôm được xác định là mắc bệnh AHPND do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình và kết quả dương tính với một trong các xét nghiệm: phản ứng PCR hoặc phản ứng Realtime PCR

Phương pháp nuôi cấy, phân lập3) và định danh vi khuẩn chỉ kết luận được đến loài Vibrio parahaemolyticus. Vì vậy cần kết hợp với phương pháp Realtime PCR hoặc PCR để xác định gen sinh độc tố gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính của vi khuẩn này.

Như vậy, đối với phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn chỉ kết luận được đến loài Vibrio parahaemolyticus nên không thể cho kết quả chính xác khi chẩn đoán bệnh hoại tử cấp tính ở tôm sú được.

Người thực hiện chẩn đoánb bệnh cần kết hợp với phương pháp Realtime PCR hoặc PCR để xác định gen sinh độc tố gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính của vi khuẩn gây nên bệnh ở tôm.