Để tiến hành phương pháp realtime PCR thì mẫu bệnh phẩm lấy từ gà có triệu chứng mắc bệnh Marek cần được xử lý như thế nào?

Nội dung chính

• Khi mắc bệnh Marek thì gà thường có một số dấu hiệu bệnh tích như thế nào?
• Áp dung phương pháp realtime PCR để chấn đoán bệnh Marek ở gà thì cần chuẩn bị những gì?
• Để tiến hành phương pháp realtime PCR thì mẫu bệnh phẩm lấy từ gà có triệu chứng mắc bệnh Marek cần được xử lý như thế nào?

Khi mắc bệnh Marek thì gà thường có một số dấu hiệu bệnh tích như thế nào?

Theo tiểu mục 5.3 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-30:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 30: Bệnh Marek ở gà thì khi mắc bệnh Marek thì dấu hiệu bệnh tích ở gà sẽ chia làm thể cấp tính và thể mãn tính, cụ thể như sau:

(1) Thể cấp tính

- Các cơ quan nội tạng như gan, lách, buồng trứng, thận, tim và dạ dày tuyến: có các u lympho tràn lan;

- Ở gà con: gan sưng ở mức độ trung bình; ở gà trưởng thành: gan sưng to;

- Các u lympho có thể thấy trên da xung quanh các nang lông và ở trong cơ lườn;

- Dây thần kinh vùng đùi, cánh sưng to.

(2) Thể mạn tính

- Một hoặc nhiều dây thần kinh ngoại biên như dây thần kinh và đám rối thần kinh hông, cánh, đám rối thần kinh bụng; thần kinh gian sườn sưng to gấp 2 đến 3 lần bình thường, phù và có màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt, mất các vạch sáng, sợi ngang và dọc;

- Đôi khi có các u lympho ở buồng trứng, thận, tim, gan và các mô khác. Các u thường nhỏ, mềm, màu nâu;

- Viêm mống mắt thể mi gây hiện tượng “mắt nâu”: đồng tử bị biến dạng, hiện tượng này phổ biến ở gà lứa tuổi từ 16 tuần tuổi đến 18 tuần tuổi.

Để tiến hành phương pháp realtime PCR thì mẫu bệnh phẩm lấy từ gà có triệu chứng mắc bệnh Marek cần được xử lý như thế nào? (Hình từ Internet)

Áp dung phương pháp realtime PCR để chấn đoán bệnh Marek ở gà thì cần chuẩn bị những gì?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-30:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 30: Bệnh Marek ở gà quy định về thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp realtime PCR như sau:

Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

...

3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp realtime PCR

3.2.1. Dung dịch PBS, pH 7,0 (xem Phụ lục A)

3.2.2. Etanol tuyệt đối, dùng cho tách chiết mẫu ADN (axit deoxyribonucleic).

3.2.3. Mẫu ADN kiểm chứng dương, tách chiết từ virus gây bệnh Marek, có giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) đã biết trước.

3.2.4. Kít tách chiết ADN.

3.2.5. Kít nhân gen.

3.2.6. Bộ mồi và mẫu dò (primers và probe).

3.2.7. Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.8. Nước, tinh khiết không có nuclease.

Bên cạnh đó, tại Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-30:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 30: Bệnh Marek ở gà quy định về thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp realtime PCR như sau:

Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

...

4.2. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime PCR

4.2.1. Máy nhân gen, (realtime PCR).

4.2.2. Máy spindown.

4.2.3. Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C.

4.2.4. Máy ly tâm, có thể tạo gia tốc ly tâm 3 000 g, 6000 g và 20 000 g.

4.2.5. Máy lắc, có thể hoạt động với tốc độ 200 r/min đến 2 500 r/min.

4.2.6. Cối chày sứ, vô trùng.

Như vậy, trước khi thực hiện phương pháp realtime PCR để chấn đoán bệnh Marek ở gà thì cần chuẩn bị một số loại thuốc thử, vật liệu thử và các thiết bị, dụng cụ theo tiêu chuẩn nêu trên.

Để tiến hành phương pháp realtime PCR thì mẫu bệnh phẩm lấy từ gà có triệu chứng mắc bệnh Marek cần được xử lý như thế nào?

Theo tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-30:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 30: Bệnh Marek ở gà quy định về việc chuẩn bị mẫu bệnh phẩm cho phương pháp realtime PCR như sau:

Phương pháp realtime PCR phát hiện virus gây bệnh Marek

6.2.1. Lấy mẫu

Chọn từ 3 con gà đến 5 con gà có triệu chứng điển hình mổ lấy dây thần kinh, gan, lách, nang lông (khối lượng tổng các loại từ 3 g đến 5 g) cho vào túi hoặc lọ đựng mẫu vô trùng, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ.

6.2.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm (6.2.1) đựng trong túi kín và được bảo quản trong thùng lạnh (có nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C và gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bảo quản trong tủ lạnh âm 20 °C (4.2.3).

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

Lấy 1 g mẫu bệnh phẩm (6.2.1) gồm dây thần kinh, gan, lách, nang lông cắt nhỏ, rồi nghiền với dung dịch PBS (3.2.1) theo tỉ lệ 1 : 10 thành huyễn dịch trong cối chày sứ (4.2.6). Ly tâm (4.2.4) huyễn dịch ở gia tốc 3 000 g trong thời gian 5 min rồi hút lấy dịch nổi để tách chiết ADN cho phản ứng realtime PCR.

...

Cần chọn từ 3 con gà đến 5 con gà có triệu chứng điển hình của bệnh Marek để mổ lấy dây thần kinh, gan, lách, nang lông (khối lượng tổng các loại từ 3 g đến 5 g) cho vào túi hoặc lọ đựng mẫu vô trùng, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ.

Mẫu bệnh phẩm đựng trong túi kín và được bảo quản trong thùng lạnh (có nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C và gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bảo quản trong tủ lạnh âm 20 °C (4.2.3).

Để sử dụng mẫu bệnh phẩm trong phương pháp realtime PCR cần lấy 1 g mẫu bệnh phẩm gồm dây thần kinh, gan, lách, nang lông cắt nhỏ, rồi nghiền với dung dịch PBS theo tỉ lệ 1 : 10 thành huyễn dịch trong cối chày sứ. Ly tâm huyễn dịch ở gia tốc 3 000 g trong thời gian 5 min rồi hút lấy dịch nổi để tách chiết ADN cho phản ứng realtime PCR.