Để chiết tách ARN từ mẫu bệnh phẩm thu được ở bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh thì cần chuẩn bị những gì?

Nội dung chính

• Có thể sử dụng kít chiết tách nào để thực hiện chiết tách ARN từ mẫu bệnh phẩm của bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh?
• Để chiết tách ARN từ mẫu bệnh phẩm thu được ở bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh thì cần chuẩn bị những gì?
• Quá trình chiết tách ARN từ mẫu bệnh phẩm thu được ở bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh được thực hiện như thế nào?

Có thể sử dụng kít chiết tách nào để thực hiện chiết tách ARN từ mẫu bệnh phẩm của bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh?

Theo tiết 7.2.1.1 tiểm mục 7.2 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-43:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 43: Bệnh lưỡi xanh quy định về việc chiết tách ARN như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

7.2 Phát hiện kháng nguyên

7.2.1 Phương pháp realtime RT-PCR

7.2.1.1 Chiết tách ARN

- Sử dụng kít chiết tách ARN vi rút Bluetongue theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/KF96 1), hoặc có thể sử dụng các loại kít chiết tách tương đương, phù hợp cho chiết tách ARN vi rút (tham khảo Phụ lục B).

- ARN vi rút sau khi chiết tách được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản ở âm 20 °C chờ đến khi tiến hành xét nghiệm.

Như vậy, bước tách chiết ARN khi thực hiện phương pháp realtime RT PCR nhằm chẩn đoán bệnh lưỡi xanh ở bò có thể sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/KF96 1), hoặc có thể sử dụng các loại kít chiết tách tương đương, phù hợp cho chiết tách ARN vi rút.

Để chiết tách ARN từ mẫu bệnh phẩm thu được ở bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh thì cần chuẩn bị những gì?

Theo điểm B.1 Phụ lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-43:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 43: Bệnh lưỡi xanh quy định về vật liệu cần chuẩn bị cho việc chiết tách ARN như sau:

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình chiết tách ADN/ARN

Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp.

Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 thì các bước được thực hiện như sau:

B.1 Chuẩn bị

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

...

Theo đó, để thực hiện chiết tách ARN từ mẫu bệnh phẩm thu được ở bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh thì cần

- Kít chiết tách ARN.

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix).

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2.

- Dung dịch Elution Buffe.

Để chiết tách ARN từ mẫu bệnh phẩm thu được ở bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh thì cần chuẩn bị những gì? (Hình từ Internet)

Quá trình chiết tách ARN từ mẫu bệnh phẩm thu được ở bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh được thực hiện như thế nào?

Theo điểm B.2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-43:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 43: Bệnh lưỡi xanh thì quá trình chiết tách ARN được thực hiện bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF theo trình tự như sau:

- Hút 200 μl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

- Giải đông, vortex huyễn dịch 10 % mẫu đã chuẩn bị (7.1.2). Sau đó tiến hành ly tâm 2500 g trong 15 phút. Hút 200 μl dịch trong bên trên vào ống Lysis buffer và trộn đều.

- Ly tâm lắng (5.2.5) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.4) và sắp xếp thứ tự trên khay.

- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi ADN/ARN của kít.

- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 μl dung dịch Elution Buffer.

- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 μl dung dịch hạt từ.

- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

- Hút toàn bộ dung dịch trong giếng đĩa thu ADN/ARN cho vào ống thu hồi 500 μl vô trùng đã ghi sẵn ký hiệu mẫu chiết tách tương ứng.

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.