Có bắt buộc phải tiến hành phương pháp PCR ngay khi nhận được mẫu bệnh phẩm có dấu hiệu nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni hay không?

Nội dung chính

• Thuốc thử và vật liệu thử trong phương pháp PCR dùng để chẩn đoán bệnh thủy sản ở bào ngư khi nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni gồm những loại nào?
• Có bắt buộc phải tiến hành phương pháp PCR ngay khi nhận được mẫu bệnh phẩm có dấu hiệu nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni hay không?
• Mẫu bệnh phẩm dùng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh thủy sản ở bào ngư khi nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni cần được chuẩn bị ra sao?

Thuốc thử và vật liệu thử trong phương pháp PCR dùng để chẩn đoán bệnh thủy sản ở bào ngư khi nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni gồm những loại nào?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-11:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ quy định về thuốc thử và vật liệu thử dùng để chẩn đoán bệnh thủy sản ở bào ngư khi nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni như sau:

Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp nuôi cấy.

3.1.1. Môi trường lỏng thioglycollat (FTM - fluid thioglycollate medium) (xem A.1).

3.1.2. Dung dịch penicilin-streptomycin (xem A.2).

3.1.3. Thuốc nhuộm lugol’s iodine (xem A.3).

3.1.4. Nystatin.

3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR

3.2.1. Etanol, 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối.

3.2.2. Kít tách chiết ADN (acid deoxyribo nucleic), protein K.

3.2.3. Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit).

3.2.4. Cặp mồi (primers), gồm mồi xuôi và mồi ngược.

3.2.5. Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.2.6. Agarose

3.2.7. Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris-acetate-EDTA) (xem A.4).

3.2.8. Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.

3.2.9. Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X).

3.2.10. Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.11. Thang chuẩn ADN (Marker)

Theo tiêu chuẩn trên thì thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh thủy sản ở bào ngư khi nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni gồm:

- Etanol, 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối.

- Kít tách chiết ADN (acid deoxyribo nucleic), protein K.

- Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit).

- Cặp mồi (primers), gồm mồi xuôi và mồi ngược.

- Nước tinh khiết, không có nuclease.

- Agarose

- Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris-acetate-EDTA)

- Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.

- Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X).

- Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

- Thang chuẩn ADN (Marker).

Có bắt buộc phải tiến hành phương pháp PCR ngay khi nhận được mẫu bệnh phẩm có dấu hiệu nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni hay không? (Hình từ internet)

Có bắt buộc phải tiến hành phương pháp PCR ngay khi nhận được mẫu bệnh phẩm có dấu hiệu nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni hay không?

Theo tiết 6.2.2 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-11:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ quy định về bảo quản mẫu bệnh phẩm như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

...

6.2.2. Bảo quản mẫu

Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C đến 8 °C không quá 48 h hoặc bảo quản trong etanol tuyệt đối (3.2.1);

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong etanol tuyệt đối (3.2.1);

Từ quy định trên thì mẫu bệnh phẩm được bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C đến 8 °C không quá 48 h hoặc bảo quản trong etanol tuyệt đối.

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong etanol tuyệt đối.

Như vậy, không cần phải tiến hành chẩn đoán liền ngay khi mẫu bệnh phẩm được chuyển tới phòng thí nghiệm đối với phương pháp PCR.

Mẫu bệnh phẩm dùng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh thủy sản ở bào ngư khi nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni cần được chuẩn bị ra sao?

Theo tiết 6.2.3 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-11:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ quy định về chuẩn bị mẫu bệnh phẩm cho phương pháp PCR trong việc chẩn đoán bệnh thủy sản ở bào ngư khi nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

...

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

Lượng mẫu cần chuẩn bị: khoảng 30 mg.

a) Mẫu trực tiếp

Thực hiện chuẩn bị mẫu như mô tả tại 6.1.3;

Bảo quản mẫu trong etanol tuyệt đối (3.2.1);

Trước khi tách chiết, lấy mẫu ra khỏi etanol và làm khô bằng giấy thấm.

b) Mẫu tăng sinh

Thực hiện như mô tả tại bước 1 và bước 2 của 6.1.4;

Dùng panh vô trùng lấy miếng mẫu bệnh phẩm ra khỏi môi trường FTM và đặt vào ống eppendorf 1,5 ml (4.2.8) để tách chiết ADN.

...

Như vậy sẽ cần khoảng 30mg mẫu bệnh phẩm dùng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh thủy sản ở bào ngư khi nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni.

Đối với mẫu trực tiếp thì cần dùng dao mổ vô trùng cắt cơ mở vỏ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và tách ra làm hai; sau đó dùng panh, kéo vô trùng cắt 1 mẫu bệnh phẩm từ 5 mm đến 10 mm của phần mô áo, mang, ruột, phần cơ bị tổn thương.

Trường hợp là mẫu tăng sinh thì cho mẫu bệnh phẩm đã chuẩn bị vào các ống nghiệm chứa 9.5 ml FTM có bổ sung thêm 0,5 ml dung dịch penicilin-streptomycin và 50 ml nystatin. Ống nghiệm được đóng kín và lắc để mẫu bệnh phẩm được chìm trong môi trường. Ủ ống nghiệm chứa mẫu bệnh phẩm trong điều kiện không có ánh sáng, ở nhiệt độ từ 22 °C đến 25 °C từ 5 ngày đến 7 ngày.