Chu trình luân nhiệt trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm được thực hiện như thế nào?

Nội dung chính

• Thiết bị dụng dụng cụ hỗ trợ khi chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm khi áp dụng phương pháp PCR gồm những thiết bị dung cụ nào?
• Việc chẩn đoán bệnh vi bào tử bằng phương pháp PCR thì cần sử dụng cặp mồi nào?
• Chu trình luân nhiệt trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm được thực hiện như thế nào?

Thiết bị dụng dụng cụ hỗ trợ khi chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm khi áp dụng phương pháp PCR gồm những thiết bị dung cụ nào?

Theo Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về thiết bị và dụng cụ dùng trong phương pháp PCR như sau:

"4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR, Realtime PCR

4.1.1 Máy nhân gen PCR

4.1.2 Máy Realtime PCR

4.1.3 Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g

4.1.4 Máy lắc trộn vortex

4.1.5 Máy ly tâm nhanh spindown

4.1.6 Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di

4.1.7 4.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

4.2.1 Khuôn nhựa, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể

4.2.2 Máy xử lý mẫu mô tự động

4.2.3 Nồi đun parafin, có thể duy trì nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C.

4.2.4 Khay sắt (loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể).

4.2.5 Máy làm lạnh tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 10 °C đến 4 °C.

4.2.6 Máy cắt tiêu bản, cắt ở độ mỏng từ 3 µm đến 5 µm.

4.2.7 Nồi dãn tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ 35 °C đến 65 °C.

4.2.8 Lam kính

4.2.9 Lamen

4.2.10 Kính hiển vi quang học, vật kính 10 X, 20X, 40 X và 100 X.

4.2.11 Máy sấy mẫu

4.2.12 Bom Canada

4.2.13 Bút ghi kính"

Theo đó, khi áp dụng phương pháp PCR vào việc chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm thì cần sử dụng các thiết bị dụng cụ theo tiêu chuẩn nêu trên.

Chu trình luân nhiệt trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm được thực hiện như thế nào? (Hình từ Internet)

Việc chẩn đoán bệnh vi bào tử bằng phương pháp PCR thì cần sử dụng cặp mồi nào?

Theo tiết 6.1.5.1 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về việc chuẩn bị cặp mồi trong phương pháp PCR như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

...

6.1.5 Cách tiến hành

6.1.5.1 Chuẩn bị mồi

Phương pháp PCR sử dụng cặp mồi EHP-510F/ EHP-510R (3.2.1) để phát hiện vi bào tử trùng do Enterocytozoon hepatopenaei. Trình tự cặp mồi (xem Bảng C.1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.9) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (20 µl mồi gốc và 80 µl nước tinh khiết không có nuclease).

Theo đó, cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR là cặp mồi EHP-510F/ EHP-510R.

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm bằng máy ly tâm nhanh spindown trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên.

Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.9) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (20 µl mồi gốc và 80 µl nước tinh khiết không có nuclease).

Chu trình luân nhiệt trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm được thực hiện như thế nào?

Theo Mục C.2 Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về việc thực hiện phản ứng PCR như sau:

"C.2 Thực hiện phản ứng PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi (3.2.1) đã được chuẩn bị sử dụng kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng C.2).

VÍ DỤ: Sử dụng kit nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656)[4])

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl mẫu ADN tách chiết từ mẫu dương tính chuẩn với EHP.

Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 5 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) theo chu trình nhiệt (xem Bảng C.3).

CHÚ THÍCH:

- Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng."

Trước tiên cần chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl mẫu ADN tách chiết từ mẫu dương tính chuẩn với EHP.

- Đối với mẫu đối chứng âm cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease và vớ mẫu thử thì cho 5 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng,

Sau đó tiến hành quá trình luân nhiệt phản ứng PCR theo các bước như bảng C.3 nêu trên.